Выбор и клонирование генной конструкции

Выбор и клонирование генной конструкции * выбар і кланаванне геннай канструкцыі * selecting and cloning of gene construction — ключевой пункт программы по переносу генов, который определяет создание оптимальных условий для последующей экспрессии трансгена в организме животного. Последовательность ДНК (любая — синтезированная, клонированная, полученная in vitro или, напр., фрагменты хромосом) может быть перенесена микроинъекцией и интегрирована в геном. В ходе приготовления фрагментов ДНК для микроинъекций учитывают следующие положения: а) в случае использования челночного бирепликонного вектора, несущего необходимую ДНК, производят удаление векторных частей с целью предотвращения подавления генной активности, влияющей на экспрессию; б) при выборе материла для клонирования предпочтение отдают последовательностям выбранных генов, а не их кДНК, т. к. при экзонно-интронной структуре трансгена в большинстве случаев усиливается его транскрипционная активность; в) при использовании кДНК дополнительно с целью усиления экспрессии в 51 или 31-области трансгена встраивают экзонно-интронную последовательность; г) обязательным компонентом любой функционально способной генной конструкции являются регуляторные элементы (промоторы, энхансеры; д) для обеспечения полноценной трансляции кодируемого белка вводят нуклеотидную последовательность сигнального белка в 51-области генной конструкции; е) для создания возможности процессинга, транспорта, транскрипции и трансляции вводят полиадениловую последовательность в 31 конец генетической конструкции. Следует учитывать форму инъецируемых молекул ДНК, т. к. она влияет на эффективность интеграции. Линейные молекулы ДНК интегрируются с частотой, приблизительно в 5 раз больше, чем кольцевые молекулы. После инъекции линейных фрагментов в мышиные яйцеклетки частота интеграции достигает приблизительно 25%.